酶和底物 在ELISA中zui常用的酶為HRP和ALP。
（1）HRP：是一種糖蛋白，含糖量約18％，分子量為44kD，在蔬菜作物辣根中含量很高。HRP是一種復合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素） 結合形成一種卟啉蛋白質。主酶為五色糖蛋白，在275nm波長處有zui高吸收峰；輔基是深棕色的含鐵卟啉環，是酶的活性基團，在403nm波長處有zui高吸收峰。HRP的純度用純度值（reinhartzahl，RZ）表示，RZ＝A403nm／A275nm，即403nm的吸光度與280nm的吸光度之比，高純度HRP的RZ值應≥3．0。HRP質量的另一重要指標是酶活力，以單位（unit，U）表示。用于標記的HRP比活性應≥250U／mg。HRP的作用底物為H202，催化下列反應；
DH2+H202 HRP D+2H2O
上式中DH2為供氫體（即底物），H2O2為受氫體。HRP對受氫體的專一性很高，除H2O2外，僅作用于小分子醇和尿素的過氧化物。HRP的底物有多種，在ELISA中常用的有：鄰苯二胺（orthophenylenediamine，OPD），四甲基聯苯胺（3，3，5，5- tetramethyl-benzidine，TMB）和2，2，-連氮基-雙-3-乙基苯噻唑啉磺酸鹽[2，2，-azino-bisc（3- ethyl-benzthiazolinesulfonate-6），ABTS]。三者各有優缺點：OPD是在ELISA中應用zui多的底物，靈敏度高，比色方便，但配成溶液后穩定性差，且有致異變性；TMB經酶作用后由五色變藍色，加酸終止反應后顯黃色，目測對比鮮明，可比色定量，溶液的穩定性也較差，但無致異變性，因此應用日見增多；ABTS雖然靈敏度不如OPD和TMB，但空白值很低。
（2）ALP：是一種磷酸酯的水解酶，用做示蹤酶的ALP活性應在l 000U／mg以上。ALP常用的底物為對硝基苯磷酸鹽（PNP），降解產物為黃色的對硝基酚。經NaOH終止酶反應后，顏色維持比較穩定。
在ELISA中酶作用于底物后生成有色物質、熒光物質或導致化學發光，分別可用分光光度計、熒光光度計測量及照度計測量。熒光和化學發光測定的敏感度均高于比色測定，標準曲線的線性范圍亦較比色反應寬，測定效果優于常用的比色ELISA。
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